摘要：将山楂叶中的水溶性多糖成分提取出来，然后通过Sevage法来除去其中的蛋白质，用透析法来除去低分子量物质，再通过离子交换柱和凝胶柱洗脱来进行进一步的分离纯化。通过电泳、凝胶柱层析和高效液相凝胶色谱法来测定多糖精品的纯度，证明其纯度很高。

关键词：山楂叶粗品多糖　纯化纯度测定

一、对山楂叶粗品多糖的分级纯化

（一）材料与方法

　　在这里，我们是用过离子交换柱和凝胶柱来达到纯化多糖样品的目的。采用的离子交换柱为CM-纤维素柱，凝胶柱则为SephadexG-100。我们采用的是先过离子柱洗脱再过凝胶柱洗脱。

1.材料

1.1仪　器

　玻璃柱(规格为Ф2×30cm),玻璃柱(规格为Ф2×100cm），LC-10ATSHIMADZU液相泵2台(一作主泵A,一作副泵B)，BSZ-100自动分布收集仪，收集管,756MC紫外分光计

1.2试剂

　　5mM的NaAC溶液（PH=4.5,0.4g/L），1N的NaCL（溶于5mM的NaAC溶液中），0.1NNaCL溶液，水为经过脱气过滤处理的去离子水。0.1g蒽酮与50ml浓硫酸混合成的蒽酮－硫酸液，均为分析纯。

1.3其它材料

CM－纤维素填料

SephadexG-100凝胶填料

两者均为进口。

2.实验方法

2.1　过CM－纤维素离子交换柱

　　先将CM－纤维素填料装入玻璃柱（规格为Ф2×23cm）中，以5mM的NaAC洗脱液将两个液相泵(A泵和B泵)与柱联接成一真空系统，以0.5ml/min的流速平衡一天，之后即可上样，采用梯度洗脱，母液为5mM的NaAC溶液，梯度液为1N的NaCL溶液（从0.2N～0.8N），上样量为5ml（浓度０.1g/ml），流速0.5ml/min，隔15min收集一管，从第20管开始进行梯度洗脱。每隔两管用蒽酮－硫酸法监测[以管号为横坐标，620nm处紫外吸收值（OD值）为纵坐标作图]，分别按相关峰位收集并冻干。之后取主要产物过SephadexG-100柱进行进一步的分离。

2.2过SephadexG-100凝胶柱

将SephadexG-100凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来，以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度０.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。

（二）结果与分析

1.过CM－纤维素离子交换柱结果

山楂叶粗品多糖KS经过CM－纤维素柱梯度洗脱，分别按相关峰位收集并冻干之后，得到四个组分：KS1、KS2、KS3、KS4（如图2）。其中，KS1占14，KS2占25，KS3占52，KS4占9，均为白色絮状物。这里，KS3是主要组分。

2.过SephadexG－100凝胶柱洗脱结果

当KS3经过SephadexG-100柱洗脱，按相关峰位收集并冻干之后，可分成两个组分KS3′、KS3″（如图3）。KS3′占28，KS3″占72。这里，根据含量比例大小的比较，KS3″为主要产物。

图2山楂叶多糖粗品（KS）过CM-纤维素柱洗脱曲线

Fig2ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS）extractonCM-cellulosecolumn

图3山楂叶多糖（KS3）过SephadexG-100凝胶柱洗脱曲线

Fig3ElutionpatternsofCrataeguspinnatifidaleaves’crudepolysaccharide（KS3）extractonSephadexG-100column

二、纯度测定

这里，纯度的测定方法我们是采用了醋酸纤维薄膜电泳法、SephadexG-200凝胶过柱法和高效液相凝胶色谱法（HPGPC）；分子量的测定则是采用了高效液相凝胶色谱法（HPGPC）。

（一）材料与方法

1.　仪　器

DYY—Ⅲ型水平电泳槽（北京六一仪器厂产）、美国产BIO-RAD电泳仪、冰箱，Waters液相色谱仪、RID-6A示差检测器，柱为MACROSEPHEREGPC（250mm×4.6mm），LC-10ATSHIMADZU液相泵、756MC紫外分光计，Waters510液相泵，5ul微量进样器。

2.　试　剂

2.1测纯度所需试剂

2.1.1醋酸纤维素薄膜电泳所需试剂

　　硼酸盐溶液：0.2N硼酸溶

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