液及KCL溶液各125ML，0.2N氢氧

化钠溶液219.5ML混合后加水稀释至1L。

氧　化　液：1.2g高碘酸溶于30ml水中，加入15ml0.2N醋酸

　　　　　　钠溶液及100ml乙醇，置暗处，可使用数日。

还　原　液：5gKI 5gNa2SO3溶于100ml水，加入150ml乙醇

　　　　　　及2.5ml2NHCL，随加随搅动，现用现配。

染　色　液：2g碱性品红溶于400ml沸水中，冷至50℃过滤，

　　　　　　通入二氧化硫气体至褪色，密封后置暗冷处保存，

　　　　　　如溶液变红，则不能使用。

　　　　冲　洗　液：1ml浓盐酸加0.4g偏重亚硫酸钾溶于100ml水中。

2.1.2HPGPC和过SephadexG-200柱所需试剂

去离子水（经过脱气过滤处理），0.1NNaCL溶液。

2.2测分子量所需试剂

去离子水（经过脱气过滤处理）,已知分子量的葡聚糖系列BluG（蓝色葡聚糖）、Wt66,900、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900、Glc(葡萄糖)、样品。这里，Wt后的数字为该标品的分子量。另外，所有标品和样品均用去离子水配成0.2浓度。标品为德国进口纯。

3.其它材料

SephadexG-200凝胶填料——进口

　醋酸纤维素薄膜——国产

4.检测多糖纯度

4.1醋酸纤维素薄膜电泳

　　取8×12cm长度的醋酸纤维薄膜，在PH10.0硼酸盐溶液中浸透后，将其夹于两张干净滤纸中间吸干，再于无光泽面点样，然后将其架于电泳槽上，尽量平直，然后用微量注射器吸取2~4μL的1的样品溶液（溶于缓冲液中），在薄膜的无光泽面上距一端2cm处呈线状点样，注意使点样线宽度不超过1mm且两端距薄膜边缘不少于4mm。点样面向下，以滤纸搭桥，取电压220V，在0℃下电泳20min，然后取出膜条置95乙醇溶液中固定，再置于氧化液中氧化6min，取出用70乙醇浸洗，之后再浸入还原液中还原8min，取出用70乙醇浸洗，然后浸入染色液中染色，至色带出现为止，再用冲洗液冲洗，则有糖区显紫红色，无糖区无色。这里，共做三个样品的电泳图谱：混合标样（Wt9,900、Wt66,000、Wt37,500、Wt20,000，比例相同）、单一标样Wt20,000的标样、KS3″。

4.2高效液相凝胶色谱法（HPGPC）

将样品用缓冲液配成0.2浓度，每次进样量为20ul，流速为0.3ml/min，温度25～30℃。

4.3过SephadexG-200柱

　　将SephadexG-200凝胶填料装柱（规格为Ф2×85cm），再通过0.1NNaCL洗脱液把A泵与柱连接起来以0.3ml/min流速平衡一天，之后即可上样，上样量为5ml（浓度0.1g/ml），用0.1NNaCL缓冲溶液以0.3ml/min流速洗脱，隔15min收集一管。以蒽酮－硫酸法监测，分别按相关峰位收集并冻干。

5.测定分子量

这里，采用高效液相凝胶色谱法（HPGPC）测定多糖精品的分子量。基本操作条件与前面的4.2HPGPC纯度测定相同，不同的是这里是依次将各个标准样品多糖洗脱，记下出峰时间tR。再将多糖样品液洗脱，记下出峰时间，然后根据公式算出对应样品的分子量。

（二）结果与讨论

1.纯度鉴定方面

1.1醋酸纤维素薄膜电泳

实验结果显示，电泳方向为由正极向负极移动。KS3″电泳图谱为单一色带，单一标品亦为单一色带，而标品混合样为一色斑（如图4）。

1.2过高效液相色谱检测

　　KS3″经过HPGPC检测为单一组分（如图5）

1.3　结　论

　　经过两种方法的检测后，我们可以认定，山楂叶多糖精品KS3″为高纯度多糖精品。　　

ABC

图4山楂叶多糖纯品（KS3″）的醋酸纤维素薄膜电泳图谱

Fig4PatternsofCrataegusPinnatifidaleavespureextractKS3″bycelluloseacetatefiberelectrophoresis

A：混合标品（Wt66,000、Wt37,500、Wt20,000、Wt9,900）

B：山楂叶多糖纯品（KS3″）

C：Wt20,000

图5山楂叶多糖纯品（KS3″）的HPGPC检测图

Fig5DeterminationofCrataegusPinnatifidaleavespureextractKS3″byHPGPC

　　

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